Aneksin V və kaspaza 3 immun boyama ilə aşkar edilən eksperimental subaraknoid qanaxmadan sonra mədəcik ətrafı orqanlarda apoptoz və nekroz
Məqsədlər: Davari mədəcik orqanları(CVO) güclü> əksər avtonom və endokrin funksiyalar üçün vacibdir. Travma və qanaxma onların fəaliyyətinə təsir göstərə bilər. Bu tədqiqatın məqsədi siçovullarda eksperimental subaraxnoid qanaxmadan sonra erkən dövrdəCVOda apoptoz və nekrozu, anneksin V yaxınlığı və kaspaza 3 immunoqrafikindən istifadə edərək araşdırmaq idi.
Metodlar: Üç eksperimental qrupdan istifadə edilmişdir: SAH-dan sonra 1 və 2-ci günlər və nəzarət qrupu, hər biri yeddi Wistar albinos siçovulu. Subaraknoid qanaxma transklival bazilyar arteriya ponksiyonu ilə həyata keçirilir. Siçovullara ürək dayanana qədər 0,9% NaCl və 0,1M fosfat tamponu pH 7,4 ilə perfuziya edildi. CVO-larda apoptoz və nekroz anneksin V boyanması ilə axın sitometriyası və kaspaza 3 immun boyası ilə ölçüldü.
Nəticələr: Organum vasculosum lamina terminalisdə apoptoz(OVLT) ,orta yüksəklik (ME),və sahə postrema(AP)1-ci gün qrupunda nəzarət qrupuna nisbətən əhəmiyyətli dərəcədə yüksək olmuşdur. Subfornisial orqan(SFO), OVLT, MEvə AP-də apoptoz 2-ci gün qrupunda nəzarət qrupuna nisbətən əhəmiyyətli dərəcədə yüksək olmuşdur. AP istisna olmaqla, 1-ci gün və 2-ci gün qrupları arasında əhəmiyyətli fərqlər var idi. SFO və OVLTda nekroz 2-ci gün qrupunda 1-ci gün və ya nəzarət qruplarına nisbətən əhəmiyyətli dərəcədə yüksək idi, halbuki ME və AP-də nekroz üç qrup arasında fərqlənmədi. . Kaspaz 3-müsbət hüceyrə sıxlığı 2-ci gün qrupunda 1-ci gün və nəzarət qruplarına nisbətən daha sıx idi.
Müzakirə: Apoptozun qarşısının alınması CVO-ların pozulmuş funksiyalarını potensial olaraq yaxşılaşdıra bilər. SAH.
Giriş
Apoptoz, subaraknoid qanaxma(SAH) kimi patoloji şəraitdə dəyişdirilən proqramlaşdırılmış hüceyrə ölümüdür. .1 Apoptozun erkən beyin zədələnməsinin,2 vazospazmın,3 və SAH-dan sonra müşahidə olunan beyin infarktlarının4 patogenezinə töhfə verən amil olduğuna inanılır. Ədəbiyyatda SAK-dan sonra apoptoz1,2,5,6 və nekroz7,8 və apoptoz inhibitorlarının qəbulundan sonra bu göstəricilərdə irəliləyişlər var.5,6 Tədqiqatlar göstərir ki, d SAH-dan sonra apoptotik yolların inhibəsi təkcə hüceyrə ölümünü azaltmadı
həmçinin funksional nəticədə əhəmiyyətli yaxşılaşma ilə nəticələndi,2,4 və ehtimal ki, bir çox ikincili zədələri basdırdı. SAH.1
Beynin bir çox dəyərli mərkəzləri ilə yanaşı, subfornisial orqan(SFO) kimi bir sıra həssas dairəvi orqanlar (CVO) , organum vasculosum lamina terminalis (OVLT), area postrema (AP) və median eminence (ME, sekretor CVO), SAH-dan təsirlənir. strong>9,10 Dairəvi mədəcik orqanları neyrotransmitterlərlə zəngindir və qan-beyin baryerindən məhrumdur.11,12
Əlavə V-nin güclü qarşılıqlı əlaqədə olduğu və xüsusi olaraq fosfatidilserin ilə və beləliklə, erkən apoptozu aşkar etmək üçün istifadə edilə bilər.15 Kaspaza 3 immuno-boyanması hal-hazırda toxuma nümunələrində apoptozu aşkar etmək üçün istifadə edilən başqa bir üsuldur.16
Bu tədqiqatda biz erkən və gec apoptozu aşkarladıq. Siçovullarda eksperimental SAH-dan sonra CVO-larda anneksin V yaxınlığı və kaspaza 3 immuno-boyanması ilə apoptoz/nekroz. Ədəbiyyatı nəzərdən keçirərkən biz bu mövzuya aid hər hansı daha əvvəl hesabat tapa bilmədik.
Materiallar və Metodlar
Tədqiqat protokolu Bu tərəfindən təsdiq edilmişdir. ¨lent Ecevit Universiteti Heyvan Etikası Komitəsi.
Təcrübələr Zonguldak, Türkiyə Bülənt Ecevit Universitetinin Tibb Fakültəsinin Eksperimental Cərrahiyyə, Araşdırma və Heyvan Laboratoriyasında həyata keçirilib. Ümumilikdə, tədqiqata çəkisi 200-300 q olan 21 erkək Wistar albinos siçovulları daxil edilmişdir. Bütün siçovullar 22-25uC temperaturda müvafiq rütubətlə, 12/12 saat işıq/qaranlıq dövrədə saxlanılıb və onlara ad libitum maye və qida verilib. Siçovullar aşağıdakı kimi üç qrupa bölündü: SAH-dan sonra 1-ci gün (n 5 7), SAK-dan sonra 2-ci gün (n 5 7) və nəzarət (n 5 7). >>
Siçovullara ketamin (60 mq/kq) və xylazin (10 mq/kq) intraperitoneal yeridilməsi ilə anesteziya edilib. Eksperimental SAH əvvəllər təsvir edilmiş Barri və digərləri,17 tərəfindən təsvir edilənə bənzər bir texnika ilə həyata keçirildi.9,10
Qısaca olaraq, servikal orta xətt kəsikləri uzanmış vəziyyətdə, əməliyyat altında edildi. mikroskop(Takagi OM-5, Yaponiya)və klivus anterior parafaringeal yanaşmadan istifadə edilərək ifşa edildi. Sümüklü külək w bazilar arteriyasının qarşısında, prepontin sisternini açmamaq üçün həddindən artıq ehtiyatla iri delikli iynələrdən istifadə edilərək yaradılmışdır. Xarici diametri 75 mm olan tikiş iynəsi(Ethicon, Livingston, UK)bazilyar arteriyaya daxil edilib. İğnənin çəkilməsi iybilmə nahiyəsinə qədər bərabər paylanması ilə subaraknoid boşluğa geniş qanaxmaya səbəb oldu. Siçovullar SAHdan sonra 1 və 2 gün ərzində müvafiq şəraitdə diri saxlanılıb.
Sıçanlar perfuziya yolu ilə evtanaziya edilib. Anesteziya altında torakotomiya aparıldı, sonra sol mədəciyin qanulyasiyası aparıldı, enən aorta sıxıldı, sağ atrium kəsildi və baş və boyun nahiyələrindən qan 0,9% NaCl və 0,1M fosfat tamponu ilə yuyuldu(pH 7,4) ürək dayanana qədər. Heyvanların başları kəsildi və SFO, OVLT, ME və AP nümunələri siçovul stereotaksik atlası(Paxinos & Watson) istifadə edərək əldə edildi.
Aneksin V metodunun prinsipi. . axın sitometriyası ilə əlavənin V-nin
apoptoz zamanı plazmanın daxili membranından xarici vərəqə köçürülən fosfatidilserinə yaxınlığını ölçməkdir. güclü > ayrı-ayrılıqda. Hər nümunə üçün 100 ml hüceyrə süspansiyonundan istifadə etdik. Annexin V floresein izotiyosiyanat(FITC)-propidium iyodidin (PI)mövcudluğunda ləkələnmiş apoptotik hüceyrələrlə birləşmişdir. Bu reaksiya apoptotik hüceyrələrin səthində fosfatidilserini aşkar etməyə imkan verir. Həm PI-müsbət, həm də anneksin V-müsbət hüceyrələr nekrotik statusun faizini göstərdi. Biz istehsalçının təlimatlarına uyğun olaraq kommersiya əlavəsi-FITC dəsti (Beckman-Coulter, Fullerton, CA, ABŞ) və Coulter FC500dən istifadə etdik. >> axın sitometri (Bekman-Kulter). Erkən apoptoz zamanı membran lipid asimmetriyasının itirilməsinin və aneksin V-nin fosfatidilserinə spesifik bağlanmasının sxematik təsviri Şəkil 1-də göstərilmişdir. 1. PI-müsbət və anneksin V-müsbət hüceyrələr gec apoptoz və ya nekrozu göstərir(Şəkil 1).
Histopatoloji və immunohistokimyəvi analiz üçün CVOlar Sıçanlardan əldə edilən beyinlər bütün qruplar üçün istifadə edildi. Hər bir siçovuldan alınan mədəcik dairəsi orqanlarının nümunələri 10% neytral formalin məhlulunda fiksasiya edilmiş və sonra parafin mumuna daxil edilmişdir. Bölmələr 5-6 mm-lik bir kriostatda kəsildi qalınlığı Sonra toxuma kəsikləri mumsuzlaşdırıldı və histomorfoloji analiz üçün hematoksilin və eozin(H&E)və kresil bənövşəyi ilə boyandı. Dairəvi mədəciyin orqanları işıq mikroskopiyası altında tədqiqat qruplarına kor olan tək patoloq(FB)tərəfindən qiymətləndirilib. Apoptozun qiymətləndirilməsi üçün poliklonal antikor antikaspaz 3(CPP32) (Neomarkers, Cat #RB-1197R7, Fremont, CA, USA)dan istifadə etməklə immunohistokimyəvi analiz də aparılmışdır. İmmun boyama formalinlə sabitlənmiş parafin mumu ilə yerləşdirilmiş toxumalardan istifadə edərək mikrodalğalı antigen axtarışı ilə streptavidin biotin peroksidaza kompleksi texnikasına əsaslanırdı. Mumla daxil edilmiş bölmələr slaydlara toplanmış və sonra mumsuzlaşdırılmış və rehidratlaşdırılmışdır. Demsizləşdirmədən sonra bölmələr endogen peroksidaza fəaliyyətini bloklamaq üçün süzülmüş suda10% hidrogen peroksidaza ilə müalicə olundu. Antigenin axtarışı üçün slaydlar mikrodalğalı sobada 10 dəqiqə ərzində 10 mmol/L sitrat tamponu(pH 7) ilə qaynadılıb. Sonra slaydlar kaspaza 3 dovşan poliklonal antikoru da daxil olmaqla, ilkin antiserum ilə inkubasiya edildi(Neomarkers, Cat #RB1197-R7, Fremont, CA, USA). Fosfat tamponlu şoran məhlulda yuyulduqdan sonra slaydlar üzərindəki toxumalar biotinlə birləşdirilmiş ikincil antikorla inkubasiya edildi, sonra otaq temperaturunda streptavidin biotin sisteminin komponentlərində 30 dəqiqə inkubasiya edildi. Reaksiyalar nümunələr 3,39-diaminobenzidin tetrahidroxlorid(DAB; Lab Vision, Fremont, CA, ABŞ)a batırıldıqdan sonra görünməyə başladı. Bundan sonra, bölmələr hematoksilinlə əks-boyandı, sonra yuyuldu və quraşdırıldı. Mənfi nəzarətdə əsas antikor buraxılmış və müsbət nəzarət kimi tonzil toxuması istifadə edilmişdir. Kaspaza 3 immunoreaktivliyi əsasən sitoplazmada müəyyən nüvə boyanması ilə müşahidə edilmişdir. Slaydlar tək bir patoloq(FB) tərəfindən kor şəkildə qiymətləndirilmişdir. Kaspaza 3-müsbət hüceyrə sıxlığı ilə ölçülən apoptoz hər qrup üçün CVO-larda qiymətləndirilmişdir.
Statistik Analiz
Sosial Elmlər üçün Statistik Paket (versiya 19.0; SPSS Inc, Chicago, IL, USA) bütün məlumat təhlilləri üçün istifadə edilmişdir. Nəticələr median və diapazon kimi ifadə edildi. Normal paylanma olmayan dəyişənlər üçün normallıq testi üçün Şapiro-Wilk testindən, üç qrup arasında müqayisələr üçün isə Kruskal-Vallis testindən istifadə edilmişdir. Conover testi idi post hoc müqayisələr üçün istifadə olunur. Bütün statistik müqayisələr üçün 0,05 statistik olaraq nəzərə alındı.
Nəticələr
Flow-sitometrik tapıntılar Cədvəl 1-də ümumiləşdirilmişdir. PI/annexin əhəmiyyətli V-dən əldə edilən qrafiklər SFO, OVLT, MEvə AP (nəzarət və 2-ci gün qrupları)nin axın sitometriya analizi Şəkildə verilmişdir. 2. 1-ci gün qrupunda median (aralıq) olaraq göstərilən erkən apoptoz nəticələri aşağıdakı kimi idi: OVLT 0,50% (0,08-1,89), ME 0,55% (0,21–0,84) və AP 0.46% (0,20–1,86),SFOda apoptoz nəzarət qrupundan əhəmiyyətli dərəcədə fərqlənməmişdir. 2-ci gün qrupu üçün erkən apoptoz aşağıdakı kimi olmuşdur: SFO 1,88% (0,97-2,99), OVLT 1,85% (0,77-3,16), ME 0,79% (0,54-1,43) və AP 0,82% (0,19-1,49) ). )bu, hər dörd sahədə nəzarət qrupuna nisbətən əhəmiyyətli dərəcədə yüksək olmuşdur. Nəzarət qrupunda erkən apoptozSFO-da 0,12% (0,02-0,35), OVLT-də 0,15% (0,04-0,71)0,18% (0,09-0,34) >> ME-də, və 0,06% (0,01–0,24) AP-də.
SFOda nekroz və 2-ci gün qrupunda OVLT həm 1-ci gün, həm də nəzarət qrupları ilə müqayisədə əhəmiyyətli dərəcədə yüksək idi və ME və AP nəticələri 1-ci gün və nəzarət qrupları arasında fərqlənmədi
SFO, OVLT, ME və AP bölmələrinin histopatoloji müayinəsi 2-ci gün qrupunda olanlara nisbətən daha çox nəzərə çarpan hüceyrə itkisi nümayiş etdirdi. digər qruplar.
Kaspaza 3-müsbət hüceyrə sıxlığı 2-ci gün qrupunda digər iki qrupa nisbətən daha sıx idi. Nəzarət qrupunda kaspaz 3-müsbət hüceyrələr az idi və 1-ci gün qrupunda 2-ci gün qrupuna nisbətən daha az kaspaz 3-müsbət hüceyrələr var idi.
Müzakirə
Apoptoz hüceyrə ölümünün təkamül mexanizmlərindən biridir, klinik və eksperimentalSAH-dan sonra görünə bilər.
Bu araşdırmada CVOs strong>eksperimental SAH,dan sonra siçovullarda apoptoz SFO, OVLT, AP, və MEdə görüldü. 1-ci gün tədqiqat qrupunda biz SFOdan başqa bütün CVOlarda fosfatidilserinə(erkən apoptoz)anksin V-nin artan yaxınlığını tapdıq. 2-ci gündə g
oxumaq: 0
